Après des études à l'université William & Mary, Jefferson commença sa carrière politique en tant que député du Parlement de Virginie de 1769 à 1775. En 1775, il fut élu à la seconde Assemblée continentale et y signa la Déclaration d'indépendance des États-Unis en 1776. Puis, en 1784, il devint le premier secrétaire d'État de George Washington et contribua au traité de Paris de 1783 qui mettait fin à la guerre d'indépendance des États-Unis.
De 1789 à 1797, Jefferson fut ambassadeur en France où il se fit l'ami de Thomas Paine et de Benjamin Franklin. En 1790, il participa également à la rédaction du statut du Virginia, fondé sur les principes de liberté individuelle et d'égalité devant la loi. Il y est à l'origine des clauses empêchant la esclavage dans le territoire.
Jefferson fut élu président en 1801, après avoir battu John Adams, son ancien collègue de la rédaction de la Déclaration d'indépendance. Son mandat est marqué par l'achat de Louisiane à la France et la guerre de 1812 contre les Britanniques. En matière domestique, il fit acheter à la loi le veto présidentiel, qui permet au chef de l'État de s'opposer à des lois jugées inconstitutionnelles.
Jefferson est surtout connu pour sa vie privée : mariée en 1790 à Martha Wayles Skelton, il eut six enfants avec elle mais seuls deux furent survivants. Après la mort de son épouse en 1782, Jefferson entretint une liaison avec Sally Hemings, esclave afro-américaine.
Jefferson meurt le 4 juillet 1826 à Monticello, au même âge que John Adams, qui était aussi son ancien collègue et rival politique. Son enterrement est devenu un événement national et la cérémonie fut l'occasion de réunir les plus grands politiciens du pays.