Il a commencé sa carrière dans le domaine de la publicité en 1976 en travaillant pour des agences comme Publicis, Saatchi & Saatchi et BDDP. Il a réalisé des spots pour des marques telles que McDonald's, Adidas et Renault.
En 1983, il a écrit et dirigé son premier court-métrage, "La Boule noire", qui a remporté plusieurs prix au festival de courts métrages de Clermont-Ferrand. En 1986, il réalise avec Jeunet le court-métrage "Monsieur Hulot's Holiday" qui connaît un grand succès et permet à ses réalisateurs de gagner le César du meilleur court-métrage en 1987.
En 1988, il réalise avec Jeunet son premier long-métrage "Le Grand Bleu", une comédie d'action qui met en scène Jean Reno et Roschdy Zem. Le film connaît un grand succès critique et public et fait de Seguy un réalisateur à part entière. Il suit avec Jeunet en 1990 "Delicatessen", lequel est considéré comme un classique du cinéma fantastique français.
En 1993, il réalise son premier film solo, "L'Auberge espagnole", une comédie romantique qui met en scène Audrey Tautou et Romain Duris. Le film est un succès critique et commercial et a donné naissance à plusieurs suites ("La Cité de l'espérance" en 2003, "L'Auberge 3" en 2014).
En 1997, il réalise avec Jeunet le film "Alién: Resurrection", la quatrième partie de la série d'horreur Alien. Le film reçoit des critiques mitigées mais est un succès commercial.
En 2003, il réalise avec Jeunet et Caro le long-métrage "Un long dimanche de fiançailles", une adaptation du roman d'Anthony Doerr, qui remporte le César du meilleur film en 2005.
En 2014, il réalise son dernier film solo jusqu'à présent, "L'Auberge 3". Gilles Seguy est actuellement en développement d'un nouveau projet de long-métrage.