Après avoir obtenu son diplôme à l'université Yale en 1966, Lefkowitz est allé à l'Université Harvard pour étudier la pharmacologie et la chimie. Il a rejoint ensuite le Département de Médecine de l'Université de Dartmouth, où il a obtenu son poste permanent en 1974. En 1980, il est allé travailler à l'Institut Howard Hughes en tant que chercheur associé et a été élu professeur titulaire au sein de la faculté de médecine de l'Université Duke en 1986.
Lefkowitz est surtout connu pour son travail sur les récepteurs de protéines G, qui jouent un rôle crucial dans la communication cellulaire. En utilisant différentes techniques expérimentales, il a réussi à cloner et à analyser les génes codant ces récepteurs, ce qui a permis une compréhension approfondie de leur fonctionnement et d'une utilisation pratique pour le développement de médicaments.
En plus de son travail sur les récepteurs de protéines G, Lefkowitz est également connu pour ses contributions à la biologie moléculaire et au développement de méthodes expérimentales pour l'étude des protéines. Il a reçu de nombreux prix et distinctions pour ses travaux, dont le Prix Albert Lasker pour la recherche médicale fondamentale en 1984, le Prix Paul Ehrlich et Ludwig Darmstaedter en 1990, et le Prix Louisa-Gross-Horwitz de l'Université du Wisconsin en 2007.
En 2012, Lefkowitz a partagé le Prix Nobel de physiologie ou médecine avec Brian Kobilka pour leurs travaux sur les récepteurs de protéines G. Le prix a été remis à Stockholm en décembre 2012.
Aujourd'hui, Robert Lefkowitz continue de travailler au sein de l'Université Duke et est reconnu comme l'un des scientifiques les plus importants de son temps dans le domaine de la biologie moléculaire.