En 1986, elle fait ses débuts au cinéma avec le film *Le Miracle des loups*. Elle obtient son premier grand rôle en 1990 dans le film *Une étrange femme vraiment*, de Jacques Doillon. Cette performance lui permet d'être nommée pour la première fois aux Césars, la plus importante cérémonie cinématographique française.
En 1994, Penélope Ferre obtient son premier grand succès commercial grâce au film *La Reine Margot*, dans lequel elle interprète la jeune et rebelle reine Margot de Valois. Cette performance lui vaut d'être nominée pour un César du meilleur espoir féminin.
En 1998, elle joue dans *La Buche* de Claude Miller, qui est l'un des plus grands succès commerciaux français de l'année et lui vaut d'être nommée pour le César du meilleur second rôle féminin. L'année suivante, elle tourne dans *8 femmes* de François Ozon, qui est présenté en compétition officielle à la Mostra de Venise 1998 et remporte le prix Louis-Delluc.
En 2002, elle fait partie de l'équipe d'acteurs de *Le Pianiste*, film de Roman Polanski qui obtient l'Oscar du meilleur film. Elle joue également dans *Gainsbourg (Vie héroïque)* de Joann Sfar en 2010.
En plus de son activité d'actrice, Penélope Ferre est également active dans le doublage de films et de séries télévisées. Elle a notamment doublé Meryl Streep dans *Sophie's Choice* (1982), Judy Davis dans *La Reine Margot* (1994) et Julianne Moore dans *Le Fantôme de l'Opéra* (2004).
Penélope Ferre est également connue pour ses activités humanitaires. Elle est notamment membre du Comité national français des ONG (ONG France) depuis 2016 et milite en faveur des droits humains, de l'égalité femmes-hommes et de la lutte contre le réchauffement climatique.