Né en France vers 1621, peu de choses sont connues sur sa vie avant qu'il ne soit recruté par la Compagnie de la Baie d'Hudson (CHB) en 1659. Il a probablement travaillé comme interprète pour les Français depuis des années avant cela, étant bilingue en français et oujibwe.
En 1659, Perrot accompagna Pierre-Esprit Radisson sur une expédition qui explore la rivière Rouge (aujourd'hui la frontière entre le Manitoba canadien et les États-Unis du Minnesota). L'expédition trouva un important poste de traite établi par des Britanniques à Sainte-Marie, au Lac Supérieur. Perrot travailla pour la CHB jusqu'en 1673. Il établit plusieurs postes de traite dans la région du lac Supérieur et fut impliqué dans les négociations avec les Amérindiens locaux.
En 1668, Perrot fut capturé par les Sioux et fut vendu aux Ojibwés. Il resta entre eux jusqu'en 1673, apprenant beaucoup de leur culture et de leur langue. Cette expérience lui fut très utile plus tard lorsqu'il travaillait pour les Français.
En 1673, Perrot revint à la CHB en tant que chef de poste de traite à La Baye (aujourd'hui Green Bay, Wisconsin). Il était connu pour être un chef de traite efficace et capable, qui travaillait bien avec les Amérindiens locaux. En 1675, il fut nommé gouverneur des postes de la CHB dans le bassin du Mississippi. Il continua à travailler pour la CHB jusqu'à sa mort en 1707.
Nicolas Perrot est considéré comme l'un des premiers colons français en Amérique du Nord. Son travail a été crucial pour les Français dans leur colonisation de la région du lac Supérieur et du bassin du Mississippi. Il a également joué un rôle important dans la culture amérindienne locale, en apprenant leur langue et leur culture et en travaillant avec eux.