Née dans une famille d'acteurs, Moss est la fille du producteur-réalisateur Ron C. O'Sullivan et de la réalisatrice-productrice Lin Singe. Elle commence sa carrière en étant révélée au public à l'âge de cinq ans en jouant le rôle d'un enfant dans le film *Perry Mason* (1985).
Après des rôles mineurs dans diverses productions télévisées et cinématographiques, elle obtient son premier rôle important dans la série *The West Wing*, où elle interprète Zoey Bartlet, la fille du président. Elle quitte cette série en 2006 pour se consacrer à d'autres projets.
En 2007, Moss rejoint le casting de la série historique *Mad Men* dans le rôle de Peggy Olson, un jeune secrétaire qui devient une des figures centrales du récit. Pour ce rôle, elle remporte trois Emmy Awards pour la meilleure actrice dans une série dramatique en 2015, 2016 et 2018. La série prend fin en 2015 après sept saisons.
En parallèle à *Mad Men*, Moss joue dans des productions cinématographiques telles que *Gettysburg* (1993), *The One I Love* (2014) et *Captain Marvel* (2019). Elle obtient également plusieurs rôles à la télévision, notamment dans les séries *Top of the Lake*, *The Handmaid's Tale* et *Sharp Objects*.
En 2017, Moss rejoint le casting de la quatrième saison de la série *The Path* dans le rôle de Sarah Cutter. Elle est également productrice du film *Her Smell* (2018) qui a été sélectionné au Festival de Sundance en 2019.
En avril 2020, Moss rejoint le casting de la saison 3 de la série *The Mandalorian* à Disney+.
Elle a également travaillé comme mannequin pour des grands magasins et des marques de mode en Amérique du Nord et de l'Europe.
Elisabeth Moss est très impliquée dans la défense des droits des femmes et est membre d'organisations telles que Time's Up et The Representation Project.