Né le 1er décembre 1967 à Bastia, en Corse, Didier Mauro grandit dans une famille modeste. Ses parents sont commerçants de fruits et légumes. Il fait ses études à l'École supérieure d'art dramatique de Nice où il découvre sa passion pour le théâtre.
En 1989, Didier Mauro est repéré par la chaîne de télévision française TF1 lors du concours "La Grande Parade", une émission de variétés à laquelle il participe. Il remporte la première édition de ce concours et commence alors sa carrière télévisuelle en 1989 avec son premier rôle dans l'émission "Les Enfants de la télé".
En 1990, il rejoint l'émission "La Classe" et devient animateur à part entière. Il co-anime cette émission jusqu'en 1994 avec Michel Denisot, puis seul jusqu'en 2006. Didier Mauro est également l'animateur des émissions de variétés "Les Années Bonheur" en 1995 et "Champs-Élysées" entre 1997 et 2003.
En 1996, il co-anime avec Laurent Ruquier l'émission "Le Grand Dîner", qui deviendra plus tard "On ne peut pas plaisanter avec un clown". Didier Mauro a également animé des émissions comme "Les 100 merveilles de la vie" (2004-2007) et "Le Grand Concours des animateurs" (2009).
En 2016, il rejoint la chaîne M6 pour présenter l'émission "Roulez les dames, roulez les messieurs".
Didier Mauro est également humoriste et acteur. Il a joué dans plusieurs films tels que "La Famille Bélier" en 2014 ou encore "Ma famille t'a déjà trouvé une petite amie" en 2018.
En 2007, Didier Mauro épouse l'humoriste et actrice Marie-Anne Chazel avec qui il a deux enfants, Tom et Emma.
Dans sa vie privée, Didier Mauro est très discret et ne parle que rarement de ses propres sentiments ou de ses problèmes personnels. Il défend souvent la cause des malades rares et a participé à diverses actions caritatives.