Elle a commencé sa carrière en tant qu'assistante de réalisation pour des réalisateurs comme Claude Miller, Philippe Garrel et Arnaud Desplechin avant de passer derrière la caméra elle-même.
En 1993, elle coécrit avec Pierre Trividic le scénario du film "Un hérostragique" dirigé par Alain Resnais, marquant ainsi ses débuts en tant que scénariste. En 1998, elle réalise son premier court-métrage, "La petite morte", qui sera sélectionné au Festival de Cannes et remporte le Prix du Jury au Festival international du film de Locarno.
En 2000, elle réalise son premier long métrage, "Le Bleu et la Noir", pour lequel elle reçoit le Prix Louis Delluc et est nommée à quatre reprises aux César. Le film raconte l'histoire d'une jeune femme, jouée par Sylvie Testud, qui traverse les différents épisodes de sa vie en tant que femme noire dans la France contemporaine.
En 2003, elle réalise le documentaire "Le Cœur des hommes", qui suit six hommes qui ont été condamnés pour des crimes violents et examinent leurs sentiments concernant leur féminité et leur masculinité. Le film est sélectionné au Festival de Cannes et est également nommé aux César.
En 2006, elle réalise "Parlez-moi d'amour", un film qui explore la sexualité lesbienne dans le contexte de l'histoire contemporaine française. Le film reçoit des critiques positives et est nommé à trois reprises aux César.
En 2016, elle réalise "Maman a tort" avec Sandrine Kiberlain dans le rôle principal, qui suit la vie d'une femme divorcée qui tente de réconcilier sa relation avec son ex-mari pour le bien de leur enfant. Le film est sélectionné au Festival de Cannes et reçoit des critiques positives.
Marie Humbert est également active en tant que productrice, notamment sur les films "Les Chansons d'amour" (2015) et "Fauteuils d'orchestre" (2016). Elle a été nommée au César pour la meilleure production en 2017.
En plus de son travail cinématographique, Marie Humbert est également active en tant que professeur à l'Institut des hautes études cinématographiques (IDHEC) et à la Sorbonne Nouvelle - Université Paris 3. Elle a également publié plusieurs articles sur le cinéma dans divers magazines et revues académiques.