Enfant prodigieux, Les Paul apprit à jouer de la guitare et du banjo dès l'âge de neuf ans. Ses premières influences étaient des musiciens country tels que Merle Travis et Arthur Smith. Il rejoignit son premier groupe, Rhythm Boys, en 1934 et commença à se faire un nom dans la scène musicale de Chicago au milieu des années 1930.
Les Paul est surtout connu pour avoir inventé l'un des outils les plus importants de la musique rock : le multitrack recording, qui permet d'enregistrer et de combiner plusieurs pistes différentes dans une seule chanson. Il développa également l'EP-8 "Log", sa propre guitare électrique à double manche, considérée comme l'une des plus importantes innovations de la guitare électrique.
Les Paul forma le duo Les Paul and Mary Ford en 1949 avec sa femme Mary Ford. Leur collaboration fut très productive et ils enregistrèrent plusieurs chansons à succès, dont "How High the Moon" (1951), qui atteignit la première place des charts pop aux États-Unis.
En 1962, Les Paul arrêta sa carrière musicale professionnelle pour se consacrer à son studio d'enregistrement à Nashville. Il revint dans le monde de la musique en 1968, après que son studio fut repris par Columbia Records, et continua à jouer et à enregistrer occasionnellement jusqu'à sa retraite définitive en 2005.
Les Paul est décédé le 12 août 2009 à l'âge de 94 ans. Son influence sur la musique rock, notamment grâce à ses innovations et à son travail avec les EP-8 "Log" et le multitrack recording, ne peut pas être sous-estimée. Il a inspiré des générations d'artistes et est considéré comme un des pères fondateurs de la musique rock moderne.