Il naquit vers 1460 sur l'île de Puerto Rico dans une famille noble, bien que les dates précises de sa naissance soient inconnues. Son père, Juan Ponce de León el Viejo, était gouverneur de Porto Rico à l'époque de la découverte de Christophe Colomb.
Sa carrière d'explorateur commença en 1493 lorsque le Capitaine général de Porto Rico, Cristobal de Talavera y Cuenca, lui confia une mission pour explorer les côtes de la Virginie actuelle (États-Unis).
En 1508, il fut nommé Gouverneur d'Hispaniola (l'actuel Haiti et la République dominicaine), un poste qu'il occupa jusqu'en 1512. Il fut par ailleurs le premier à introduire l'usage de chiens pour la recherche de l'or sur les terres espagnoles d'Amérique latine.
Il partit vers la Floride en 1513, commandant quatre navires et environ 200 hommes. C'est lors de cette expédition qu'il découvrit la Floride actuelle. Il parcourut près de 2000 kilomètres le long de la côte est des États-Unis, passant par les Carolines, les Virginies et le golfe du Mexique.
Il donna à la région le nom de La Florida ("La Terre de la Flor") en référence aux nombreuses orchidées qu'il trouva dans cette région tropicale.
Cependant, il ne parvint pas à découvrir le mythique "Pays des Bienheureux" (le Mythique pays de la Canne-à -sucre), qui est souvent identifié avec les Bahamas. L'idée que Juan Ponce de León ait recherché un lieu appelé l'"île de la Canne-à -sucre", où il pourrait se rajeunir, est une légende romantique.
Juan Ponce de León est mort en 1521 lors d'une expédition militaire contre les Taïnos, une tribu amérindienne de Porto Rico. Il est considéré comme un héros national de Porto Rico et de la Floride, mais il reste surtout célèbre pour avoir donné son nom à l'État américain de la Floride et au mythique "Pays des Bienheureux".