Malkovich a grandi dans une famille de milieu modeste en Illinois. Il s'est intéressé très tôt à la scène et a rejoint le théâtre de l'université de Goddard après avoir quitté l'Université d'Illinois Urbana-Champaign.
Sa carrière cinématographique a commencé dans les années 1980, avec des rôles dans des films comme "Rendez-vous" (1984), "Places in the Heart" (1984) et "Retour vers le futur" (1985). Mais c'est probablement le rôle de Cyrus à travers la trilogie des films "Dans la peau de John Malkovich" (1995) qui est resté son plus célèbre.
En tant qu'acteur, il a reçu un prix Tony et a été nommé à trois reprises aux Oscars pour ses rôles dans "Dans la peau de John Malkovich" (1995), "Le Maître d'école" (1998) et "La Grande Beauté" (2003). Il a également participé à plusieurs films comme "Le Roi Arthur" (2004), "Transsiberienne" (2007), "Changeling" (2008), "Le Fantôme de l'Opéra" (2011) et "Couleurs pas claires" (2016).
En plus de sa carrière d'acteur, John Malkovich est également réalisateur et scénariste. Il a écrit et réalisé des films comme "Le Château des espions" (1995), "La Ligne rouge" (2003) et "The Dancer Upstairs" (2002).
John Malkovich est également connu pour son activisme en faveur des droits des animaux et de l'environnement. Il est le cofondateur de la société de production Animal Kingdom Foundation et a été nommé ambassadeur de bonne volonté de l'Organisation des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture (FAO).
En 2017, il reçoit le prix David di Donatello à Rome pour sa carrière exceptionnelle. En 2019, il est fait chevalier de la Légion d'honneur par le ministre de la Culture français Franck Riester, en reconnaissance de ses contributions exceptionnelles à la culture française et mondiale.