Connu pour son rôle de Martin Crane dans la série télévisée *Frasier*, il a également tenu des rôles marquants au cinéma, notamment dans les films *Le Fugitif* (1993), *Une merveilleuse vie* (2004) et *Moonstruck* (1987).
John Mahoney est né d'une mère irlandaise catholique et d'un père américain protestant. Il grandit dans un quartier défavorisé de Chicago et découvre le théâtre au lycée, où il rejoint la compagnie scolaire. Après des études à l'Université Loyola de Chicago, il travaille pendant plusieurs années comme vendeur d'instrumentation pour la compagnie McDonnell Douglas avant de faire carrière dans le théâtre.
John Mahoney commence sa carrière sur scène dans des pièces de théâtre off-Broadway et obtient son premier grand succès à Broadway en 1978 avec *The Elephant Man* de Bernard Pomerance, dans lequel il tient le rôle de l'acteur John Merrick. Il reçoit un Tony Award pour ce rôle.
En 1984, John Mahoney fait ses débuts à la télévision avec le rôle de Karl Lohman dans la série *St. Elsewhere*. Il devient alors connu et apprécié des critiques et du public pour son talent d'acteur. En 1993, il obtient un Emmy Award pour son rôle de Martin Crane dans la série *Frasier*, qui lui vaut également cinq nominations à cet award.
En plus de sa carrière sur scène et à la télévision, John Mahoney travaille aussi au cinéma et participe notamment aux films *Le Fugitif* (1993), *In the Line of Fire* (1993), *Une merveilleuse vie* (2004) et *The American President* (1995).
John Mahoney est également actif dans le doublage de films d'animation, notamment pour les personnages de Carl Fredricksen dans *Up* et de Boss Nass dans *Star Wars, épisode I : La Menace fantôme*.
John Mahoney décède à Londres en 2018 des suites d'un cancer. Il laisse derrière lui une épouse et trois enfants.