Dee étudia à Cambridge où il acquit une solide formation universitaire en mathématiques et en sciences naturelles. Il se consacra ensuite à la géographie, à l'astronomie et à l'astrologie, devenant rapidement un spécialiste reconnu de ces domaines.
En 1547, il devint maître des arts du collège Trinity à Cambridge. En 1562, il fut nommé astrologue royal par la reine Élisabeth Ire d'Angleterre et il occupa cette fonction jusqu'en 1589. Il fut également conseiller en matière de finance pour les gouverneurs de la Compagnie des Merchants Adventurers of London.
Dee était aussi intéressé par l'occultisme et la magie, notamment la magie angélique. Il prétendait pouvoir communiquer avec les esprits supérieurs grâce à un automate qu'il appelait le scrypter (lui-même inspiré de l'astrologue Arnaud de Villeneuve), qui était en réalité une boule de cristal sur laquelle il regardait pendant ses séances de divination.
Dee fut un pionnier des voyages vers les Indes orientales et il fut un défenseur ardent de l'expansion coloniale anglaise en Amérique du Nord, notamment dans le domaine de la navigation. Il a également écrit plusieurs ouvrages sur ces thèmes, qui ont été publiés après sa mort.
Son existence fut marquée par des crises financières et des désillusions personnelles. En 1589, il fut accusé d'avoir pratiqué la sorcellerie et il dut quitter sa résidence à Mortlake, près de Londres. Il finit ses jours dans un monastère où il mourut en 1608.
Malgré les controverses et les suspicions qui l'ont entouré tout au long de sa vie, John Dee est reconnu comme un précurseur des sciences mathématiques, astronomiques et géographiques en Angleterre. Sa correspondance avec le philosophe Francis Bacon, son œuvre magique et ses écrits sur la navigation ont été une source d'inspiration pour de nombreux intellectuels qui ont suivi après lui.