Fletcher fit ses études au lycée public de Philadelphie avant d'opter pour une carrière dans le théâtre, où il jouait des rôles comiques. En 1897, il fonda la compagnie de théâtre Fletcher-Craig avec sa femme, Lilla C. Craig, et voyagea à travers les États-Unis pour mettre en scène des productions théâtrales.
En 1906, Fletcher décida de se lancer dans le cinéma, qui était alors une nouvelle forme d'art naissante. Il fonda la compagnie Essanay Film Manufacturing Company à Chicago et produisit de nombreux films courts avec sa propre troupe d'acteurs. En 1912, il s'installa à Los Angeles pour suivre l'essor du cinéma sur la côte ouest des États-Unis et fonda la compagnie Universal Film Manufacturing Company.
John B. Fletcher jouait souvent dans des rôles de personnages comiques et de méchants dans ses films, notamment dans le film muet *The Squaw Man* (1914), qui était considéré comme un des premiers longs-métrages de cinéma américain. Il contribua à l'essor du cinéma en créant de nouvelles techniques cinematographiques, telles que la caméra à traction mobile pour filmer les séquences de poursuite à grande vitesse et les effets spéciaux optiques.
Fletcher a également contribué à l'industrie du cinéma en créant des studios permanents avec une infrastructure adaptée au tournage, ce qui était nouveau à l'époque. Il a été l'un des premiers producteurs de cinéma à réaliser que les acteurs devaient être payés pour leur travail et qu'ils devraient avoir un contrat avec la compagnie de production.
En 1920, il fut nommé président du Sindicat des Acteurs (Actor's Guild), qui devint plus tard l'actuel Syndicat des Acteurs de l'Association américaine des producteurs de films et télévision (Screen Actors Guild). Bien que sa carrière cinématographique ait pris fin en 1923, il est considéré comme une figure clé dans la naissance du cinéma muet. John B. Fletcher est décédé à Los Angeles le 14 décembre 1925.