Il est diplômé de l'École nationale de théâtre du Canada (ENTC) en 1974, où il a été formé par des metteurs en scène comme Marcel Sabourin et Jean-Louis Roux. Ses débuts sur scène à l'ENTC se font sous la direction de René Richard Cyr et Yvon Dufour avec la pièce "Le Chien des orfèvres".
En 1975, il débute au théâtre professionnel en interprétant le rôle d'Oedipe dans une adaptation de la pièce antique "Oedipe-roi" de Sophocle. Ce fut le début d'une longue et fructueuse carrière de comédien qui l'amena à jouer dans plus de 100 productions théâtrales, dont les pièces "Les Belles-Sœurs", "Un homme est mort", "Les Fous de Bassanio" et "La Maison de Bernarda Alba".
En 1978, il fait ses débuts à la télévision avec le rôle principal du docteur Michel Lépine dans la série télévisée "Le Repenti" produite par Télé-Québec. Sa carrière sur petit écran s'est poursuivie avec des rôles notables dans les séries "Saguenay-Lac-Saint-Jean", "Kamouraska", "La Petite Vie" et "Les Belles Histoires des orphelins Tétard".
Sur grand écran, il a joué dans plusieurs films québécois notables, dont "Le Déclin de l'empire américain", "Mon Trésor", "La Neuvaine" et "Dans une galaxie près de chez vous". Il est également connu pour avoir interprété le personnage du prêtre Maurice Lafrance dans la série télévisée "Sous un ciel variable", diffusée sur Radio-Canada entre 1986 et 2005.
En tant que réalisateur, il a tourné des épisodes de plusieurs séries télévisées québécoises, dont "Les Belles Histoires des orphelins Tétard" et "Sous un ciel variable". Il a également réalisé des longs métrages tels que "Le Voyageur imprudent" (2014) et "L'Échange" (2016).
Enfin, il est l'auteur de plusieurs scénarios pour la télévision et le cinéma, notamment les longs métrages "Mon Trésor" (1987), "La Neuvaine" (1993) et "Le Voyageur imprudent" (2014).
Au cours de sa carrière, Jean-Pierre DeFonteine a reçu plusieurs récompenses pour son travail, notamment deux Prix Gémeaux pour ses rôles dans les séries télévisées "Sous un ciel variable" et "Les Belles Histoires des orphelins Tétard". Il est également devenu Officier de l'Ordre national du Québec en 2019.