Jean-François L'Amour a grandi à Saint-Lambert, une ville de banlieue située au sud-ouest de Montréal. Il est diplômé du Département d'art dramatique de l'Université de Montréal en 1983.
En 1984, il gagne la première édition du Grand Prix Rire de Montréal et obtient ainsi le prix d'un contrat pour enregistrer une cassette audio. L'année suivante, il joue dans son premier long-métrage, *On aura tout vu*, réalisé par Denis Arcand.
En 1986, il interprète le rôle de Gilles Legault dans la série télévisée québécoise *Lance et compte : Le Grand Duel*. Cette même année, il reçoit le prix Jean-René pour ses contributions à l'humour au Québec.
En 1987, il joue un rôle principal dans la série télévisée *Le Cirque du Monde*, qui remporte le Grand Prix Rire de Montréal et est nommé aux Geminis. Il est également nominé pour le prix Gémeaux en 1987, 1988 et 1989 pour ses rôles dans la série télévisée *Les Belles Histoires des orphelins Télémaque*.
En 1989, il joue aux côtés de Gérard Depardieu dans le film *Jean de La Lune*, réalisé par Denys Arcand. Cette même année, il crée sa propre émission télévisée, *L'Amour est dans le pré*, qui devient rapidement une grande réussite et lui apporte une célébrité nationale.
En 1995, il joue aux côtés de Geneviève Bujold dans la série télévisée *Le Clan Delorme*. Il reçoit le prix Génie en 1997 pour son rôle dans le film *L'Amour, la Folie et l'Enfer*, réalisé par Denis Arcand.
En 2003, il joue aux côtés de Jean-Louis Trintignant et Sandrine Bonnaire dans le film français *Ma mère* réalisé par Kristian Lupa.
Jean-François L'Amour est toujours actif sur scène et à la télévision aujourd'hui, notamment dans sa propre émission télévisée *Le Grand Jeu*, diffusée sur TVA depuis 2015.