James Doohan a commencé sa carrière à la radio canadienne en 1943, travaillant sur des émissions telles que *The National Dream* et *Frontier Town*. Après avoir servi dans l'armée américaine pendant la Seconde Guerre mondiale, il est revenu à Vancouver pour poursuivre sa carrière dans la radio.
En 1957, James Doohan a déménagé à New York pour tenter de trouver plus d'opportunités dans le monde du divertissement. Il a fait une apparition à la télévision en tant que producteur dans le jeu *The Name's the Same*. Cependant, c'est avec sa participation à l'émission The Man from U.N.C.L.E. en 1964 qu'il a vraiment connu son premier grand succès.
Le 7 septembre 1966, il a auditionné pour le rôle de Montgomery Scott dans Star Trek. Le casting étant déjà clos, le directeur Gene Roddenberry lui offre le rôle pour sa voix typique et sa capacité à incarner l'humour et la simplicité du personnage.
Après la diffusion de la série Star Trek en 1969, James Doohan a joué son personnage dans les films dérivés tels que Star Trek: The Motion Picture (1979), Star Trek II : La Colère de Khan (1982), Star Trek III : Le Retour de la colère de Khan (1984), Star Trek IV : Par-delà l'inconnue (1986) et Star Trek V : L'Ultime Frontière (1989).
James Doohan a également fait des apparitions en tant que Scotty dans plusieurs séries télévisées de Star Trek, notamment *Star Trek: The Animated Series* (1973-1974), *Star Trek: Deep Space Nine* (1993) et *Star Trek: Voyager* (1995).
James Doohan a été un acteur très apprécié par les fans de Star Trek, avec qui il a entretenu une relation étroite jusqu'à sa mort. Il a également écrit plusieurs livres sur le rôle de Scotty et l'univers de Star Trek, dont *I Am Not Spock* (1975) et *Behind the Scenes with Spock* (1982).