Avant son nomination au poste de directeur du FBI, Comey était connu pour ses positions en matière d'enquête sur la fraude financière à Wall Street et pour avoir indiqué qu'il y avait eu des activités criminelles lors des élections présidentielles américaines de 2008.
Comey est diplômé de la Phillips Exeter Academy et du Harvard College, où il obtient un Bachelor of Arts en philosophie. Il rejoint ensuite l'université de Louisville pour y étudier le droit.
Comey commence sa carrière juridique en tant qu'avocat privé à New York avant d'être nommé procureur de la ville de New York sous l'administration du maire Rudolph Giuliani. Il occupe ensuite des fonctions au sein du département de la Justice des États-Unis, notamment comme procureur en chef adjoint pour le district du Columbia.
En 2013, il est nommé Directeur du FBI par le président Barack Obama. Son mandat sera marqué notamment par l'enquête sur les émails de Hillary Clinton et sa décision de publier une lettre au Congrès dès que des nouveaux courriels seraient découverts, à quelques jours de l'élection présidentielle.
En juillet 2016, après la démission du procureur général Loretta Lynch, le président Obama lui octroie un nouvel mandat de quatre ans en tant que directeur du FBI. Mais Comey sera limogé par le nouveau président Donald Trump en mai 2017, dans un contexte d'enquête sur la collusion entre la campagne de Trump et la Russie lors des élections présidentielles américaines de 2016.
Depuis sa sortie du FBI, Comey a publié une livre intitulé "A Higher Loyalty: Truth, Lies, and Leadership" dans lequel il relate son expérience à la tête de l'agence et ses réactions à certains événements controversés.