Après avoir obtenu son doctorat en pharmacie à Paris, Proust a commencé sa carrière scientifique comme professeur à la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Montpellier. En 1867, il est nommé titulaire de la chaire de chimie analytique à l'École Normale Supérieure (ENS) de Paris.
En 1875, Gaspard Proust a été élu membre de l'Académie française, prenant place au fauteuil 29 qui avait appartenu à Claude Louis Berthollet. En 1886, il est élu à l'Académie des Sciences dans la section de chimie, prenant la suite de Marcellin Berthelot.
Proust a travaillé sur une grande variété de sujets, mais il est peut-être le plus connu pour son travail sur les protéines et sur la coloration de l'albumine. Il a également étudié la constitution des matières grasses, les corps colorants naturels et artificiels, la chlorophylle et la photosynthèse, les amino-acides, etc.
Un exemple significatif de ses travaux sur les protéines est son expérience sur la dénaturation des globulines. En 1867, il a montré que le chauffage ou l'action du chlorure d'hydrogène causait une alteration de la conformation tridimensionnelle des protéines, rendant leurs propriétés chimiques différentes et les rendant faciles à séparer.
Proust a également découvert le glucide méthylé qu'il nomma d-glucitol et il a développé une méthode pour détecter la présence de l'alcool et du sucre dans les boissons en utilisant une solution de chlorure de zinc, une méthode encore utilisée aujourd'hui.
Proust est mort à Colombey-les-Deux-Églises en 1897 et il repose dans le cimetière de Colombey-les-Deux-Églises près de Chaumont (Haute-Marne).