Il fit ses études à La Roche, puis à Clermont-Ferrand où il fut ordonné prêtre en 1593. Au début de sa carrière ecclésiastique, François de Sales fut un défenseur fervent de la Contre-Réforme et s'engagea dans les controverses avec les protestants de Genève.
En 1602, il fonda une congrégation de femmes à Annecy, les Filles de la Charité, vouées à l'éducation des enfants pauvres et aux soins des malades. Cette congrégation connut un grand succès et fut reconnue par le Saint-Siège en 1607.
En 1602 également, il rencontra Jeanne de Chantal et entama avec elle une correspondance spirituelle qui est aujourd'hui considérée comme un chef-d'œuvre de la spiritualité chrétienne. Ensemble, ils fondèrent la congrégation des Visitationnes, à laquelle appartiennent les Sœurs de la Charité de Nevers.
En 1604, François de Sales fut nommé évêque de Genève et engagé dans une longue lutte pour le retour de cette ville au catholicisme. Il s'imposa comme un modèle d'évêque pastoral en visitant régulièrement les paroisses et en donnant des conférences populaires, dont on a conservé plusieurs textes dans ses œuvres.
François de Sales est surtout connu pour son livre "La Vie intérieure ou l'oraison", publié pour la première fois en 1608, dans lequel il expose sa théorie de la prière dévotionnelle et de la spiritualité affective. Ce livre fut un grand succès et est considéré comme une des oeuvres maîtresses de la littérature spirituelle chrétienne.
François de Sales fut canonisé le 19 décembre 1665 par le pape Alexandre VII, il a été proclamé Docteur de l'Église en 1879 et est fêté le 24 janvier.