En 1982, il obtient un diplôme en théâtre de l'Université McGill à Montréal. Au début de sa carrière, Fontaine travaille dans des petits rôles à la télévision et au cinéma. Il remporte son premier grand succès télévisuel en 1986 avec le rôle d'Émile Lajoie dans la série "L'Ark" qui est diffusée sur Radio-Canada.
En 1988, Fontaine tient le rôle principal de François Dumont dans la série "La Famille Plouffe", qui connaît un grand succès populaire et critique. La même année, il joue dans le film "Bon Cop, Bad Cop" qui est considéré comme un classique du cinéma québécois.
En 1992, Fontaine anime la première édition du prix Gémeaux, les Prix de l'Académie canadienne du cinéma et de la télévision. Il continue à animer cette cérémonie jusqu'en 2008, ce qui en fait un des présentateurs de télévision les plus longevifs au Canada.
En 1994, Fontaine crée sa propre compagnie de production, la Société de développement de productions Lionel Fontaine Inc., et produit plusieurs émissions à succès pour Radio-Canada, dont "Le monde en une heure", "La semaine des grands magazines" et "C't'à toi".
En 2008, Fontaine présente l'émission "Les enfants de la télé" sur TVA, qui est un documentaire consacré à la carrière des plus grandes célébrités de la télévision québécoise. La même année, il reçoit le prix du meilleur animateur au Gala des prix Gémeaux.
En 2010, Fontaine produit et présente "L'émission Lionel Fontaine", une émission d'actualité de la société Radio-Canada qui est diffusée sur les ondes de ICI Radio-Canada Télé. La même année, il reçoit le prix du meilleur animateur aux prix Gémeaux pour l'émission "C't'à toi".
En 2017, Fontaine présente la 3e édition de "L'Odyssée des célébrités", une émission de télé-réalité diffusée sur TVA, dans laquelle il accompagne les candidats dans leurs parcours d'entraînement physique et psychologique pour participer à un grand événement sportif.
En 2018, Fontaine produit et présente "L'incroyable révélation", une émission de télé-réalité diffusée sur TVA, dans laquelle il met au défi les candidats de se faire reconnaître par des acteurs professionnels. La même année, il reçoit le prix du meilleur animateur aux prix Gémeaux pour "L'émission Lionel Fontaine".
En 2019, Fontaine présente la 4e édition de "L'Odyssée des célébrités" et produit et présente "Le grand défi du Québec", une émission de télé-réalité diffusée sur TVA, dans laquelle il accompagne les candidats dans leurs parcours d'entraînement pour participer à des compétitions sportives dans le monde entier.
En 2020, Fontaine produit et présente "L'incroyable révélation" pour une deuxième saison, ainsi que la première édition de "Les enfants de la télévision", un documentaire consacré à la carrière des plus jeunes animateurs de la télévision québécoise.
En 2021, Fontaine présente la 5e édition de "L'Odyssée des célébrités" et produit et présente "Le grand défi du Québec" pour une deuxième saison. Il reçoit également le prix du meilleur animateur aux prix Gémeaux pour "L'émission Lionel Fontaine".
Fontaine est marié à la journaliste et animateuse Sylvie Boucher depuis 1997, et ils ont deux enfants ensemble.