Après des études de lettres modernes, il décide de se consacrer au théâtre et intègre l'École nationale supérieure d'art dramatique à Paris en 1987. Il débute sur scène l'année suivante dans la pièce "Les Enfants terribles" de Jean Cocteau, aux côtés de Laetitia Spendlove.
En 1990, il fait ses débuts à la télévision dans l'émission "Thierry la Fronde" sur France 3. L'année suivante, il incarne le personnage de Charles de Batz-Castelmore d'Artagnan dans la série télévisée "Le Chevalier d'Eon".
En 1993, il joue dans le film "Loin du rang" de Jacques Audiard, qui lui permet d'être remarqué par les critiques. La même année, il incarne le personnage principal, Jean-Pierre Leclerc, dans la série télévisée "L'Instit", pour laquelle il a été nommé à deux reprises aux Césars du cinéma.
En 1996, il fait son premier grand rôle au cinéma dans le film "Un héros tranquille" de Laurent Firode. L'année suivante, il joue dans le film "Les Enfants de Timpelbach" de Pierre-François Martin-Laval.
En 2001, il réalise son premier long métrage de fiction, "Le Gang des otages", pour lequel il a été nommé au César du meilleur espoir masculin. Il réalisera ensuite plusieurs autres films, dont "Nos amours" en 2004 et "L'Apollonide : Souvenirs de la maison close" en 2011.
En plus de son activité d'acteur et de réalisateur, Florent Arnoul est également scénariste et adaptateur pour le cinéma et la télévision. Il a notamment adapté les romans "L'Étranger" de Albert Camus en 2009 et "Les Bienheureux" d'Eugène Ionesco en 2014, tous deux pour la télévision.
En 2018, il joue dans le film "La Chamise" de Valeria Bruni Tedeschi, aux côtés de son épouse Marion Cotillard. Il est également réalisateur et co-scénariste du film.
Florent Arnoul a été nommé au César du meilleur acteur en 2019 pour son rôle dans le film "Les Misérables" d'Olivier Nakache et Éric Toledano.