Charles commença son règne en Espagne à l'âge de 19 ans. Son frère aîné Jean avait préféré une vie monastique et avait renoncé au trône. À sa majorité, Charles se vit confier les royaumes d'Aragon, de Valence et du Portugal (qu'il dirigeait depuis la mort de son oncle Manuel en 1521). Il réunit ainsi les couronnes espagnoles sous l'unique règne du roi éphémère Ferdinand le Catholique.
En 1516, Charles est élu empereur germanique. Sa couronne impériale était partagée entre la France et la Germanie, ce qui conduisait à des conflits incessants avec les rois de France. Les deux monarques se disputaient alors les couronnes de Charlemagne et la suprématie en Europe.
Charles Quint mena plusieurs guerres contre François Ier de France, dont la plus célèbre est la Guerre italienne (1521-1530). Ces conflits durent à des divergences territoriales, politiques et économiques, mais surtout au fait que les deux souverains étaient en compétition pour le contrôle de l'Italie.
Charles Quint a également mené des guerres contre les Ottomans, notamment la Guerre de Chypre (1570-1573), dont il s'empara grâce à une armada composée de 208 navires et d'un énorme nombre de soldats. Il a également contribué à freiner l'expansion ottomane dans la Méditerranée.
Charles Quint est mort en 1558, à Yuste, dans l'actuelle province de Cáceres (Espagne). Son règne est marqué par le dynamisme économique et culturel qui caractérisait son empire : la période des grands troubadours, de Vasco de Gama ou de Michel-Ange sont quelques exemples. Charles Quint a également contribué à unificater l'Espagne, en éliminant les derniers foyers d'indépendance régionale et en favorisant la diffusion de la langue espagnole au sein de ses territoires.