Après des études secondaires à Paris, il suit les cours du Conservatoire national supérieur d'art dramatique et fait ses débuts sur scène au Théâtre national populaire (TNP) en 1952, sous la direction de Jean Vilar. Sa carrière cinématographique démarre en 1953 avec le film *La Ferme du Pilor* de René Clément.
En 1959, il obtient son premier grand rôle au cinéma dans *Huit Hommes et demie* de Claude Autant-Lara. Il se distingue par sa carrière pluridisciplinaire : outre le théâtre et le cinéma, il est également chanteur et peintre.
Il rencontre un grand succès en 1961 avec *Les Bonnes* de Claude Chabrol, puis obtient en 1964 l'un de ses rôles les plus connus : celui d'Emmanuel, dans le film *Le Clan des Siciliens* de Henri Verneuil.
Dans les années 1970 et 1980, il travaille régulièrement avec les cinéastes François Truffaut (*L'Amour en fuite*, 1979), Claude Sautet (*Les Choses de la vie*, 1970) et Michelangelo Antonioni (*Professione reporter*, 1975).
Il est révélé à un large public en 2003 par le film *Le Pianiste* d'Alain Resnais, pour lequel il obtient une nomination au César du meilleur acteur. Son dernier grand rôle, dans *La Vie d'Adèle* de Abdellatif Kechiche (2013), lui vaut une seconde nomination au César.
Jean-Louis Trintignant a également été un militant écologiste actif tout au long de sa vie, notamment en défendant la cause des grands espaces naturels et en participant à plusieurs documentaires sur le thème de l'environnement.
Sa carrière cinématographique s'étale sur plus de six décennies, durant lesquelles il a tourné avec près de deux cents réalisateurs différents. Il est considéré comme l'un des acteurs les plus importants du cinéma français.