Née à New York, D'Harnoncourt a obtenu un baccalauréat en beaux-arts au Smith College et un diplôme de l'Institut des études supérieures des arts (ISCP) de New York. Après des années d'expérience dans le monde de la vente aux enchères, elle estvenue directrice adjointe de la Galerie des Beaux-Arts de Philadelphie en 1976 et a été promue à la direction générale en 1982.
Au cours de son mandat à Philadelphie, D'Harnoncourt a ouvert la galerie aux communautés locales tout en accroissant le nombre d'expositions temporaires exposées. Elle est également créditée pour avoir aidé à développer les programmes d'art contemporain de la galerie et pour sa promotion des artistes locaux et internationaux.
En 1992, elle a été nommée directrice générale de la National Gallery of Art (NGA), où elle a poursuivi son travail en faveur des arts visuels en organisant des expositions d'artistes américains et internationaux tels que Cy Twombly, Jasper Johns, Cindy Sherman, Richard Avedon, Chuck Close et Kehinde Wiley. Elle a également travaillé pour renforcer la collection permanente de l'NGA en s'assurant que les œuvres d'art importantes soient acquises par le musée.
Parmi ses contributions à la profession, D'Harnoncourt est reconnue pour son leadership et sa vision en art contemporain, ainsi que pour son engagement avec les communautés locales et internationales. Elle a également été connue pour être une ardente défenseur des droits des femmes dans le monde de l'art.
Anne D'Harnoncourt est décédée d'un cancer en 2008 à l'âge de 67 ans. Son épouse, Suzanne Ramljak, a continué son travail après sa mort et a servi comme directrice générale intérimaire jusqu'à la nomination d'une nouvelle directrice générale en 2015.